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光学显微术-比色法
时间:2013-10-25 下面是一个阐明如何设置和运行比色法断定的是在溶液中的一种物质，的浓度。 一般方式 在显微镜下，我们不能把资料和计数每单位体积的分子数的方式，我们可以盘算每单位体积的细胞数。我们必需找到的显微镜，我们可以测量浓度的物质好处是成正比的。在试验中使用的最常用的测量光接收。比尔定律告知我们，如果溶质吸收特定波长的光，吸光度在溶液中的物质浓度成正比。一个装备称为分光光度计是用于丈量并显示在可量化的单位和/或记载吸光度。通常情形下，物质本身不接收光线，以便为实际检测。我们可能不得不雇用一个或多个生产中的比例未知浓度的有色化合物的试剂。 测量样品的光吸收告知我们很少的，除非我们有一个比拟标准。例如，如果样品X显示吸光度为0.5，什么是X的实际浓度？如果我们有一个已知浓度的样品，样品也给了0.5吸光度的，那么我们有理由信任，该物质具有相同浓度。假设你有一个样品的数目，其浓度变更。这将是有益的，有一个标准，涵盖了全方位我们未知的浓度可能的数量。这就是标准曲线。我们准备了一系列的已知浓度的X标准，从低到高浓度。我们运行的每一个标准的检测和情节吸光度与浓度。应用此标准曲线，我们可以读出浓度为未知其吸光度浏览。 把持 当我们运行一个试验，我们必须确保只有我们化验的物质是光吸收的波长范围内的好处负责。应坚持雷同的标准和未知的所有预备条件。如果样本缓冲区中的溶质影响吸光度，然后我们有一个问题。我们将无法获得正确的结果，如果我们不同的卷中，我们筹备和检测标准和未知。读取吸光度的时光，我们坚持温度下的资料，和所有其他物理因素应坚持不变。由于它并不总是可行的，所有的未知和标准使用雷同的缓冲区的，我们只需要确保没有任何缓冲区的组成部分，吸光度显着的后果。 当我们用相同体积的所有标准和未知的，我们简化了相当的剖析。标准曲线的绘制吸光度与物质，而不是集中量。这可能是与工作，而做一个实验金额减少混杂，尤其是假如需要稀释。只要你知道在实验中使用的样本，原始卷，浓度测定是很轻易的。 并发症 所有的检测有很大的局限性。一些最低限度以下物质的金额将被检测到。除了一些最大的量或浓度趋于饱和，这是一个试验，在数量或浓度的增添不会影响吸光度。我们一般会尝试一个实验，即吸光度成正比集中的线性范围内的工作。幻想的情形下，我们将设立标准，涵盖全部有用的检测范围。也就是说，我们优化的检测范围。 通常一个样品是如此集中，当你检测样品规定的量，结果是封闭的规模 – 检测试剂是饱和的。该解决计划则是稀释样品。例如，如果每个标准品或样品量是1毫升，1毫升你未知，给出一个成果是封闭范围，可以参加0.9 ml缓冲，0.1 ml样品试管。如果你读了从标准曲线的浓度，然后乘以10的结果，得到样品的实际浓度。如果你读的金额，然后从标准曲线简略地除以0.1毫升的量，以获得你的注意力。 当样本是如此集中，你不能吸管一个足够小的金额正确，您可能要进行系列稀释。 例：预备一个标准曲线 我们将成立一个假设性的试验来丈量物资X确当X混杂，形成一个庞杂的检测试剂，接收光波长为400毫微米。我们的分光光度计请求，我们在每个试管2 ml量。一个反映杯中是一个透明的容器必需放置在光路测量吸光度。为了得到准确的比例进行采样检测试剂，我们使我们的样本量0.5毫升，参加1.5毫升显色剂，以每管。以这种方法检测，可以检测到低至10微克（μg）的X金额为2毫克（mg）。 参考 要校准分光光度计，我们须要一个参考管是雷同的，在每一个方面的标准和样品，但它不包括任何物质与光路径十，禁止分光光度计将设置为只读无穷吸光度（不透光在所有）。随着在光路中的参考管，我们会设置的分光光度计读取零吸光度。这样一来，样品含有X将在该范畴内的吸光度。参考管是用来给我们的最大的动态范畴。 对于这个假设的例子将包括参考0.5毫升样品缓冲液和显色剂1.5毫升。 标准 这个例子描写了一个假设的检测仅用于阐明目标。 我们盼望，我们可以得到的最佳精度，和我们的产品规模跨越两个数量级，所以设立的标准曲线的方式之一是与一个标准的对数进展。我们需要从0.01毫克，2毫克的标准。让我们尝试金额为0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1和2毫克。最后的差距是相当普遍的，所以让我们抛在一个标准的，也就是说，1.5毫克。要准备的标准，它是便利的开端与该物质的浓缩原液。我们所须要的数额最大的是2毫克，在一个体积为0.5 ml。只给我们一点点的“盘旋余地”让我们做一个原液5毫克/毫升的物质X，下表列出了盘算。 |
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